Analyse von Protein-Phosphorylierungsgraden mit Massenspektrometrie

Reversible Proteinphosphorylierung ist ein Schlüsselprinzip der intrazellulären Signaltransduktion. One-source-Peptid-/Phosphopeptid-standards wurden mit dem Ziel entwickelt, Phosphorylierungsgrade von Proteinen positionsspezifisch und mit hoher Genauigkeit zu bestimmen. Kernpunkt der Methode ist die Erzeugung einer Mischung eines stabilisotopenmarkierten Peptid-/Phosphopeptid-Standardpaars, dessen stöchiometrisches Verhältnis exakt bekannt ist. Die Standards wurden Proteinverdaus zugesetzt und diese mittels Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie analysiert. Im Vordergrund dieser Arbeit steht die Analyse der dualen ERK1/2-Phosphorylierung durch die MAPK-Kinase MEK. Die ERK-Signalkaskade spielt eine zentrale Rolle in der Antwort von Zellen auf extrazelluläre Stimuli wie Wachstumsfaktoren und Zytokine. Dennoch sind die Mechanismen der dynamischen ERK-Aktivierung und –Deaktivierung in vivo nicht vollständig verstanden. Mit Hilfe von one-source-Standards wurde erstmals ein zweistufiger, distributiver ERK-Phosphorylierungsmechanismus in primären Maushepatozyten nachgewiesen.